Peter Parker (Tobey Maguire) und sein Alter Ego Spider-Man bekommen es diesmal gleich mit mehreren Gegnern zu tun. Erzfeind dürfte dabei der Sandman Flint Marko (Thomas Haden Church) sein. Aber auch der Konflikt zwischen ihm und seinem langjähreigen Freund Harry Osborn (James Franco) spitz sich weiter zu. Dabei tritt Harry in die Fußstapfen seines Vaters und wird zu einem zweiten "Grünen Kobold". Als ob dies alles nicht schon genug wäre, gilt es, auch dem mysteriösen Venom (Topher Grace) Einhalt zu gebieten und die problembeladene Beziehung zur Jugendliebe Mary Jane (Kirsten Dunst) zu ordnen...
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